Inmunoensayo por detección de fluorescencia polarizada

Un Inmunoensayo por detección de fluorescencia polarizada mejor conocido como FPIA por sus siglas en inglés (Flourescence Polarization ImmunoAssay), es un inmunoensayo de tipo competitivo en fase homogénea, muy utilizado en ensayos de laboratorio clínico para la cuantificación de analitos que se encuentran en muy baja proporción en los líquidos biológicos, del orden del microgramo o nanogramo por mililitro, tales como hormonas, drogas terapéuticas, drogas de abuso, vitaminas y algunos aminoácidos, de importancia clínica.

Principio de funcionamiento

FPIA, al igual que todos los inmunoensayos se basa en la propiedad que tienen los anticuerpos de unirse con alta afinidad y especificidad a un determinado antígeno esta propiedad es utilizada para reconocer específicamente al analito de interés, y por medio de diferentes mecanismos, generar una señal que puede ser medida. En el caso de FPIA la señal que se mide es luz fluorescente polarizada.

Inmunoensayos competitivos

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FPIA se trata de un ensayo de tipo competitivo en fase homogénea; como en todos los inmunoensayos competitivos, un anticuerpo específico para reconocer a la molécula de interés es puesto en contacto con la muestra biológica que contiene el analito y con una cantidad conocida de la misma molécula de interés unida químicamente a otra molécula que sirve de "marca" o "etiqueta" capaz de generar una señal mensurable, la molécula natural presente en la muestra biológica compite por los sitios de unión en los anticuerpos con la molécula marcada y al final de un cierto tiempo necesario para que el sistema se estabilice, la proporción de moléculas marcadas unidas a los anticuerpos resulta inversamente proporcional a la cantidad de molécula natural presente en la muestra. Esta proporción de molécula marcada unida al anticuerpo es la que genera la señal que se mide. En los ensayos competivos por lo tanto la señal producida es inversamente proporcional al analito presente en la muestra (A menor cantidad de analito, mayor es la señal y viceversa); esta propiedad permite cuantificar con facilidad muy pequeñas cantidades y variaciones en la concentración de un analito.

En lo que se distingue FPIA de otros inmunoensayos competitivos es en la forma en que se genera y detecta la señal. En FPIA la molécula marcadora es fluorescente, y lo que se detecta es la luz polarizada en un plano específico generada por la fluorescencia de la marca.

Fluorescencia

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Una sustancia fluorescente es aquella que es capaz de absorber energía luminosa a una determinada longitud de onda, para luego emitir parte de esta energía absorbida a mayor longitud de onda, el resto de la energía absorbida es liberada por la molécula en forma de calor al chocar con otras moleculas iguales o con moléculas del solvente en el que se encuenta. El proceso se puede resumir en tres pasos:

1) Excitación: Un par de electrones de uno de los orbitales moleculares en estado energético basal (S₀) recibe un cuanto de luz adquiriendo así un estado energético mayor o excitado en un estado vibracional alto S_1*.

$S_0 + h \nu_{ex} \to S_1*$

2) Decaimiento (disipación) no radiante: El par de electrones excitado S_1* pierde parte de su energía por un proceso que no emite luz, hasta adquirir un estado excitado de menor energía vibracional (S₁), intermedio entre S₀ y S_1*. (ver articulo principal para mas detalles sobre los diferentes mecanismos para este proceso)

$S_1* \to S_1 + \delta E$

3) Emisión: El electrón excitado en estado vibracional bajo disipa esa energía en forma de un cuanto de luz, hasta adquirir un estado energético basal en un estado vibracional alto. Como la diferencia de energía entre S₁ y S_0* es menor que entre S₀ y S_1*, el cuanto de luz que se produce es menos energético y posee una longitud de onda mayor.

$S_1 \to S_0* + h \nu_{em}$

Polarización de la fluorescencia

Aunque el proceso de fluorescencia se caracteriza por tener tiempos muy cortos, (los tres pasos se realizan en tiempos que van entre los micro y nanosegundos), lo cierto es que no es instantáneo. Esto puede ser comprobado al iluminar una solución de una sustancia fluorescente con luz polarizada, los electrones excitados emiten luz en el mismo plano de polarización en que la reciben, pero en una solución las moléculas se encuentran chocando entre si y girando sobre sí mismas al azar. Al girar una molécula sobre sí misma también gira el plano de polarización de la luz que emite. Si el tiempo de emisión fuera muy corto en relación a la velocidad de giro de la molécula la luz emitida se encontraría practicamente en el mismo plano de polarización que la luz recibida, en cambio si el tiempo de decaimiento fuera largo en relacion a la velocidad de giro de las moleculas la luz emitida se econtraría en planos muy diferentes a la luz excitadora. Si las moléculas en solución son pequeñas, pueden girar sobre si mismas a una gran velocidad, por lo que al iluminar una solución fluorescente con luz polarizada la luz emitida obtenida contiene numerosos planos de polarización al azar, es decir es no polarizada. Mientras que si las moléculas fluorescentes son grandes giran muy lentamente y en comparación casi todas las emisiones se producen en el mismo plano de polarización que la excitación, por lo que la luz obtenida es, principalmente, polarizada.

Generación de la señal en FPIA

En FPIA la molécula competidora marcada es fluorescente y comparativamente pequeña, por lo que presenta altas velocidades de rotación en relación a su tiempo de decaimiento. Pero cuando la molécula marcada se une a un anticuerpo, que tiene una masa de varios cientos de miles de daltons, gira mucho mas lentamente. La moléculas libres al ser iluminadas con luz polarizada generan luz no polarizada, pero las moléculas marcadas unidas al anticuerpo que giran mucho mas lentamente emiten luz polarizada. La intensidad de la luz polarizada obtenida es por lo tanto proporcional a la cantidad de molécula competidora marcada unida al anticuerpo e inversamente proporcional a la cantidad de molécula natural presente en la muestra de interés.

Arreglo estructural para la medición en FPIA

El arreglo estructural para la medición en FPIA es muy sencillo, cuenta con una lámpara emisora capaz de generar una buena intensidad en la región corta del espectro (UV-Azul), luego un polarizador que deja pasar sólo la luz polarizada en un determinado plano y un monocromador que permite seleccionar la longitud de onda excitadora; a continuación se encuentra la cubeta transparente que contiene la muestra, después otro polarizador orientado en el mismo plano que el primero,a continuación cuenta con otro monocromador capaz de seleccionar la longitud de onda de emisión del sistema, para finalmente contar con un fotodetector capaz de cuantificar la cantidad de luz recibida.

Sustancias usualmente cuantificadas Por FPIA

Debido a la naturaleza de la técnica se encuentra limitada para la cuantificación de moléculas de pequeño tamaño y relativamente bajo peso molecular en solución tales como el ácido valproico, homocisteína, fenobarbital, difenilhidantoína (fenitoína), ciclosporina A, canabinoides tales como el THC, benzodiacepinas, antidepresivos tricíclicos, cocaína, metotrexato, anfetaminas, amikacina, gentamicina, vancomicina, salicilatos, carbamazepina, acetaminofen, everolimus, algunas hormonas tales como la tiroxina y el cortisol, vitaminas tales como el ácido fólico y aminoácidos de importancia clínica tales como la metionina y la homocisteína entre otros.

Bibliografía

• Streitwieser A, Heathcock CH. Química Organica 3º ed. Ed. Panamericana; 1986.
• Harlow E, Land D, eds. Antibodies: A Laboratory Manual. New York:Cold Spring Harbor Laboratory; 1988.
• Moore WT, Eastman RC, eds. Diagnostic Endocrinology. Toronto: BC Decker; 1990.
• Will D, editor. The Inmmunoasay Book. New York: Stockton Press; 1994.
• Kricka L. Human anti-animal antibody interferences in inmmunological assays. Clin Chem. 1999; 45:942-956.
• Abbott Diagnostics - Introducción a los Inmunoensayos. http://latinoamerica.abbottdiagnostics.com/ciencia/pdf/1_d.pdf