ADN polimerasa

Las ADN polimerasas intervienen en la replicación del ADN para dar a cada célula hija una copia del ADN original en el proceso de la mitosis. Llevan a cabo la síntesis de la nueva cadena de ADN emparejando los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) con los desoxirribonucleótidos complementarios correspondientes del ADN molde. Los dNTP que se usan en la replicación del ADN contienen tres fosfatos unidos al grupo hidroxilo 5' de la desoxirribosa y dependiendo de la base nitrogenada serán dATP, dTTP, dCTP o dGTP. La reacción fundamental es una transferencia de un grupo fosfato en la que el grupo 3'-OH actúa como nucleófilo en el extremo 3' de la cadena que está en crecimiento. El ataque nucleofílico se produce sobre el fosfato α (el más próximo a la desoxirribosa) del desoxirribonucleósido 5' trifosfato que entra, liberándose pirofosfato inorgánico y alargándose el ADN (al formarse un nuevo enlace fosfodiéster). A diferencia de la mayoría de procesos biológicos que ocurren en la célula en los que sólo se separa un grupo fosfato (P_i), durante la replicación se separan los dos últimos grupos fosfato, en forma de grupo pirofosfato (PP_i)...

Este proceso se puede resumir en una ecuación química:

(DNA)_n + dNTP ↔ (DNA)_n+1 + PP_i

A pesar de que la ADN polimerasa sólo tiene un sitio activo para emparejar los cuatro dNTPs diferentes, la unión correcta de los pares de bases A:T, C:G es posible basándose en la geometría de éstos: si la unión es incorrecta se produce un desplazamiento del fosfato α haciendo más difícil su unión al extremo 3'-OH y ralentizando así el ritmo de catálisis, lo que da lugar a que la ADN polimerasa añada preferentemente las bases correctas.

Las ADN polimerasas pueden añadir hasta 1000 nucleótidos por segundo. Esto es debido a su naturaleza procesiva, es decir, el número de nucleótidos que son capaces de añadir cada vez que se asocian al molde de ADN que van a copiar. Dado que la adición de los nucleótidos es un proceso que dura unos milisegundos, la velocidad de catálisis va a depender del tiempo que la ADN polimerasa permanece unida al ADN, esto es, de su procesividad.

Función correctora exonucleasa 3' → 5' de las ADN polimerasas.

El crecimiento de la cadena se produce en dirección 5' → 3', ya que se requiere de un grupo 3'-OH libre para el inicio de la síntesis puesto que éste es el que realiza el ataque nucleofílico sobre el fosfato α del dNTP, de forma que las ADN polimerasas requieren de un iniciador 3'-OH (que puede ser de ADN o ARN) llamado cebador que es sintetizado por la ARN primasa. El extremo 3' del cebador se denomina extremo cebador.

Las ADN polimerasas también realizan otras funciones durante el proceso de replicación. Además de participar en la elongación, desempeñan una función correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de éste. Es importante que existan estos mecanismos de corrección ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN darían lugar a mutaciones.

ADN polimerasas de E. coli

Las principales ADN polimerasas en E. coli son las ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, y cada una de ellas está especializada en una o más de estas funciones según cuál sea su papel en la replicación. La procesividad se relaciona con cuánto tiempo permanece unida la ADNpol al ADN cuando está agregando nucleótidos. Así, la ADN Pol I que es poco procesiva (añade entre 20 y 100 nucleótidos por acontecimiento de unión), es la encargada de la eliminación de los cebadores y el "relleno" del espacio que dejan con ADN (actividad exonucleasa 3' → 5' y actividad polimerasa 5' → 3'). La ADN Pol II está encargada de la reparación de los quiebres producidos en el ADN (actividades polimerasa 5' → 3' y exonucleasa 3' → 5'), la ADN Pol III que es muy procesiva es la principal encargada de la elongación del ADN (actividad polimerasa 5' → 3') durante la cual también realiza tareas de corrección (actividad exonucleasa 3' → 5'). Notar que actividad correctora y de reparación no son lo mismo. Sólo la ADN pol I y beta tienen actividad de reparación, en cambio todas las polimerasas tienen actividad correctora (poseen 2 sitios activos: un sitio de polimerización y otro de corrección). ¿Por qué ocurre? ¿Cómo se da cuenta la DNApol de que hubo un error en la replicación del ADN? Ocurre por el fenómeno de tautomerización. Los nucleótidos cambian a su forma química alternativa, la DNApol las confunde con otro nucleótido y lo elonga. Cuando este vuelve a su conformación más estable provoca un cambio en el ancho de la hebra (20A) y termina abriéndose. Esto es detectado por la polimerasa, quien cambia conformacionalmente y deja la hebra posicionada en el sitio de corrección. Las ADN Pol IV y V, identificadas en 1999, están involucradas en una forma poco común de reparación del ADN.

Características principales de las ADN polimerasas de E. coli

		ADN Pol I	ADN Pol II	ADN Pol III
Estructura	Masa molecular (dalton)	109.000	90.000	900.000
	Constitución	Monómero	Monómero	Dímero asimétrico
	Número de polimerasas / célula	400	Desconocido	10 - 20
Actividad / Función	Polimerasa 5' → 3' / Elongación	SI	SI	SI
	Exonucleasa 3' → 5' / Corrección	SI	SI	SI
	Exonucleasa 5' → 3' / Reparación	SI	NO	NO

Holoenzima ADN Pol III de E. coli.

A diferencia de lo que ocurre con la ADN Pol I, que sólo debe añadir unos 5-10 nucleótidos una vez eliminado el cebador, es importante que la ADN Pol III sí sea muy procesiva, y por esa razón suele formar parte de un complejo denominado holoenzima ADN Pol III que le da una mayor procesividad. Este complejo consta de diversas subunidades polipeptídicas encargadas cada una de una función, y que constituyen en su conjunto un dímero asimétrico: una mitad se encarga de la síntesis de la hebra adelantada y la otra mitad de la hebra rezagada. El corazón catalítico lo componen las subunidades α que corresponden a dos copias de la ADN Pol III, la subunidad ε con actividad correctora exonucleasa 3' → 5' y la subunidad θ cuya función podría ser la de ensamblar las otras dos; las subunidades τ mantienen la estructura dimérica; el complejo γ lo conforman las subunidades γ y δ cuya su función es la de aumentar la procesividad de la ADN Pol III; la subunidad β sujeta la ADN Pol III al ADN.

Actividad correctora exonucleasa 3' → 5' de la subunidad ε de la holoenzima ADN Pol III.

ADN polimerasas eucarióticas

Hay 13 tipos aunque las más importantes son dos:

• ADN polimerasa α (alfa): Se encuentra en el núcleo celular, se inhibe por alidilcolina y en humanos presenta 4 subunidades, aunque las más importantes son dos:
  • Subunidad mayor (130 kDa): tiene actividad polimerasa
  • Subunidad menor (48 kDa): tiene un centro activo de primasa para sintetizar el cebador necesario para la replicación pero carece de actividad exo 3'→5' por lo que no corrige errores.

• ADN polimerasa σ (sigma): Se localiza en el núcleo celular y se inhibe mediante alidilcolina. Tiene una o dos subunidades dependiendo el organismo. Tiene una alta capacidad de polimerización y actividad correctora de errores (exo 3'→5'). Carece de actividad primasa.

La primasa (que es parte de la molécula de ADN polimerasa α) sintetiza ARN cebadores y además comienza la elongación con DNA de las dos cadenas. Después se produce un cambio de polimerasa y entra la ADN polimerasa σ, que continúa la síntesis.

Reacción en cadena de la polimerasa

Artículo principal: Reacción en cadena de la polimerasa

La propiedad de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN se utiliza para la reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés, para obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, amplificándolo para propósitos de investigación. En los procesos de PCR se requiere la utilización de polimerasas termoestables, como la Taq DNA polimerasa, debido a que es necesario aplicar altas temperaturas para desnaturalizar la molécula de ADN.

Bibliografía

• Watson, J. D. et al. 2006. Biología Molecular del Gen (5ª Ed.). Madrid: Médica Panamericana. 84-7903-505-6.
• César Benito Jiménez, Profesor Titular de Genética, Departamento de Genética, U.C.M.. «La Replicación».